多肽在细胞信号传导、免疫应答和代谢调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。肽段组成的细微变化，例如单个氨基酸的改变或翻译后修饰的引入，均可能对其结构、功能及生物活性产生显著影响。因此，如何在单分子水平精准识别多肽序列及修饰状态的细微差异，是生物标志物检测、疾病机制研究、药物质量控制和蛋白质测序等领域面临的重要技术挑战。

近日，生命科学与技术学院薛剑煌/阎双红课题组在《纳米生物技术》（Journal of Nanobiotechnology）杂志上发表了题为“Discriminating Single-Amino Acid Differences and Post-Translational Modifications in Negatively Charged Peptides with α- Hemolysin Nanopores”的研究论文。该研究提出了一种基于工程化α-溶血素纳米孔的多肽识别策略。通过在纳米孔内引入精氨酸残基，并采用氨基化环糊精作为分子适配体，研究人员成功实现了对长度仅相差一个氨基酸残基的带负电荷均聚短肽的区分与多种翻译后修饰的灵敏识别。

研究团队以谷氨酸均聚肽为模式肽展开研究。为增强纳米孔与带负电荷多肽之间的相互作用，研究人员在α-溶血素（α-HL）纳米孔的M113和T145位点引入了带正电荷的精氨酸，构建α-HL(M113R/T145R)突变体。在此基础上，进一步将8-氨基-γ环糊精（am8γCD）作为分子适配体嵌入孔道，利用其与肽段之间的主客体相互作用，构建了α-HL(M113R/T145R)-am8γCD传感体系。该体系能够稳定捕获谷氨酸均聚肽并产生特征性电流信号。实验结果表明，该多肽纳米孔检测体系可在单氨基酸分辨率下区分长度为4-10个氨基酸的谷氨酸均聚肽，同时还能检测短至仅含2-3个氨基酸的肽段，展现出对短肽的高灵敏检测能力。此外，该传感体系同样能够稳定识别并区分长度仅相差一个氨基酸的天冬氨酸均聚肽，进一步验证了其对不同类型短肽的单氨基酸分辨能力。

在此基础上，研究人员进一步探索了α-HL(M113R/T145R)-am8γCD传感体系对多肽翻译后修饰的识别能力，成功区分了带负电荷模型肽的磷酸化、乙酰化和乳酸化等不同翻译后修饰。同时，研究人员将蛋白质酶解为肽段，通过检测不同蛋白酶解产物的特征性纳米孔信号，并结合深度学习分析，实现了对不同钙结合蛋白的识别与区分，平均分类准确率达97.85%，展现出该体系在蛋白质识别方面的应用潜力。

总体而言，该研究通过在α-HL纳米孔关键位点引入带正电荷的精氨酸，并结合am8γCD分子适配体，构建了一种针对带负电荷短肽的高灵敏纳米孔传感体系。该体系不仅实现了短至2个氨基酸肽段的无标记检测以及均聚肽的单氨基酸分辨，还能够有效区分乙酰化、乳酸化和磷酸化等不同类型的翻译后修饰。在此基础上，研究人员进一步将该体系拓展至蛋白质酶解肽段分析，并结合深度学习算法实现了基于酶解肽段纳米孔指纹的蛋白质识别。该研究为短肽精细表征、翻译后修饰分析及蛋白质鉴定提供了新的单分子检测策略，未来结合蛋白质酶解肽段指纹数据库及高通量纳米孔平台，有望进一步拓展至复杂生物样本分析、肽类生物标志物检测及蛋白质鉴定等应用领域。

论文链接：https://link.springer.com/article/10.1186/s12951-026-04818-z